方案推薦|奧譜天成ATR8800冬季高發呼吸道疾病的快速檢驗

引言

冬季是呼吸道感染疾病的高發期，目前我國流行的呼吸道疾病由多種病原體引起，包括細菌、支原體、流感病毒以及引發全球大流行的新型冠狀病毒等。鑒于呼吸道疾病具有傳染性高、傳播速度快的特點，且不同病原體引發的呼吸道感染在癥狀和治療方面存在顯著的差異，因此及早進行檢測和確診是有效遏制呼吸道疾病擴散的重要手段。盡管傳統的分離培養方法在準確性和權威性方面具備顯著優勢，但由于其操作繁瑣、耗時較長，以及涉及生物安全風險等缺點，已經無法滿足當前臨床檢測的實際需求。目前主要采用的檢測方法包括核酸檢測和免疫學檢測，然而這些方法都要求配備專業實驗室設備，操作人員需要接受專業培訓，成本相對較高，同時檢測周期也較為冗長，無法滿足迅速增加的呼吸道疾病樣本大規模現場檢測的迫切需求，因此迫切需要開發新型的呼吸道病毒檢測技術。

當光照射到物質上發生散射時，波長發生變化的散射光被稱為拉曼散射。波長發生改變的原因是光子與被照射物質分子間發生能量轉移后，分子振動能級發生了改變，而光子在不同物質上發生拉曼散射時轉移的能量不同，就可特異性識別被照射物質種類。而表面增強拉曼光譜（SERS）技術則是在普通拉曼散射的基礎上將被照射物質吸附或連接于粗糙貴金屬表面，使拉曼信號強度獲得極大提升。在普通拉曼散射固有的無損分析、不受水成分影響、樣品不需要復雜處理、檢測速度快、使用便攜式儀器可進行現場分析等優勢基礎上，SERS技術具有更高的靈敏度，在某些條件下可以達到單分子檢測水平。通過分析患者的生物樣本，這項技術可以迅速檢測特定的分子標志物，從而確定引發呼吸道疾病的特異致病原。有助于醫療專業人員更早地作出確切的診斷，為患者提供更及時、個體化的治療方案。通過縮短診斷時間和減少傳統檢查的繁瑣過程，快速檢驗方法有望在防控傳染病、提高醫療效率和減輕醫療負擔等方面發揮關鍵作用，為呼吸道疾病的治療提供更為有效的支持。

SERS技術在新冠病毒（COVID-19）檢測方面的應用

新型冠狀病毒是第7種能感染人類的冠狀病毒且具有極高的傳染性，因此開發一種超快速、高靈敏的新型檢測方法顯得尤為緊迫。LEONG等人設計了一款基于SERS技術的手持式新型冠狀病毒檢測儀。該儀器內部集成了三種芯片，分別搭載了2-巰基苯甲酸、4-巰基吡啶和三磷酸腺苷3組SERS探針分子。這些SERS探針分子被固定在銀納米顆粒表面上。在檢測過程中，被檢者向設備呼氣約10秒，由于呼氣中的新型冠狀病毒生物標志物與傳感器發生化學反應，因此可以通過SERS信號的變化對反應后的化合物進行表征。對于在醫院和機場對501人進行的新型冠狀病毒現場檢測，LEONG等人的研究結果顯示，該檢測方法的假陰性率為3.8%，假陽性率為0.1%。這與聚合酶鏈反應檢測相比具有相當的準確性，而且成本更低，檢測時間僅需5分鐘。值得注意的是，該儀器不僅能夠檢測生物源揮發性有機物的種類變化，還可用于篩查其他類型的呼吸道病毒感染。

圖1 基于呼吸揮發性有機化合物識別新冠病毒陽性個體的方案設計。

SERS技術在流感病毒檢測方面的應用

流感病毒具有較高的傳染性和變異率，可能引發季節性流行，甚至導致全球性大流行，對公共衛生造成嚴重負擔。因此，迫切需要研究一種準確和迅速的流感病毒檢測方法，以在流感爆發前通過及時、精確的檢測來遏制其傳播。Chen等研發了一種基于雙模式表面增強拉曼散射（SERS）的適體傳感器，可同時準確診斷和區分新冠病毒和甲型H1N1流感。在這一技術中，具有選擇性結合SARS-CoV-2和甲型H1N1流感的DNA適體被共同固定在爆米花狀的金納米基底上。拉曼報告基因（Cy3和RRX），連接到DNA適體末端，可在金納米基底的納米間隙中產生強烈的SERS信號。同時，內標拉曼報告基因（4-MBA）與適體DNA一同固定在金納米基底上，以減小測量環境變化引起的誤差。當SARS-CoV-2或甲型流感病毒接近金納米基底時，由于相應的DNA適體與病毒之間存在顯著的結合親和力，相關的DNA適體會選擇性地從基底上分離。因此，隨著目標病毒濃度的增加，相應的SERS強度逐漸降低。這種基于SERS的DNA適體傳感器可迅速確定疑似患者是否感染了SARS-CoV-2或甲型流感，同時以高靈敏度定量評估目標病毒濃度，不受交叉反應的影響。

圖2 (a) 感染SARS-CoV-2或甲型流感時出現的癥狀，以及用于診斷的RT-PCR和快速抗原試劑盒；(b)爆米花狀金納米基底的照片和SEM圖像；(c)用于病毒檢測的雙適體固定爆米花狀金納米基底的工作原理。

SERS技術在細菌感染檢測方面的應用

細菌感染是致死的主要原因，在發達國家和發展中國家每年奪去670萬人的生命。這些感染的治療費用也很高，僅在美國就占年度醫療支出的8.7%，即330億美元。目前的診斷方法需要進行樣本培養來檢測和識別細菌及其抗生素敏感性，這是一個緩慢的過程，即使在***的實驗室中也可能需要數天的時間。通常在等待培養結果時會開出廣譜抗生素，根據疾病控制和預防中心的數據，超過30%的患者接受了不必要的治療。因此需要快速、無培養診斷細菌感染的新方法，以便能夠更早地開出針對性抗生素并幫助減輕抗菌素耐藥性。拉曼光譜有潛力識別細菌的種類和抗生素耐藥性，當與共焦光譜結合時，可以機械能單個細菌細胞的分析。不同的細菌表型具有獨特的分子組成，導致其相應的拉曼光譜存在細微的差異。然而，由于拉曼散射效率較低（~10⁻⁸散射概率），這些細微的光譜差異很容易被背景噪聲掩蓋。因此，需要高信噪比才能達到高識別精度，通常需要很長的測量時間，而這阻礙了高通量單細胞技術的發展。此外，大量臨床相關物種、菌株和抗生素耐藥性模式需要全面的數據集，而這些數據集在專注于區分物種分離株或抗生素敏感性的研究中并未收集到。Ho等人通過SERS技術結合卷積神經網絡訓練應對了這一挑戰，通過分離、經驗治療和抗生素耐藥性對細菌SERS光譜進行分類。

圖3 卷積神經網絡用于從SERS光譜中識別細菌。

小結

隨著SERS技術的進步，目前在檢測領域主要有三種應用思路：(1) 將特異性核酸序列和抗體附著在納米顆粒表面，構建SERS標簽，從而在復雜體液中實現對呼吸道病毒的準確檢測；(2) 利用新型增強基底制備技術，使納米顆粒之間的“熱點”尺寸更適合病毒顆粒，提高檢測效率、降低成本，同時有效避免了唾液、血液等生物背景對檢測結果的干擾；(3) 與其他檢測技術聯合應用，如SERS-色譜聯合技術，將SERS增強基底組裝到光纖上作為高靈敏的檢測傳感器。此外，結合SERS和等離子體傳感可用于生物分子相互作用的高靈敏度定量檢測。SERS技術克服了普通拉曼光譜信號較弱的缺點，提供了難以獲得的結構信息。

SERS技術在呼吸道疾病病原檢測中取得顯著進展，然而，為了更全面、深入地研究和診斷呼吸道病毒，研究者通常會選擇使用共聚焦顯微拉曼光譜儀。這種儀器結合了激光共聚焦顯微鏡和拉曼光譜儀的特點，為呼吸道疾病病原的SERS檢測提供了獨特的優勢：

高空間分辨率：共聚焦顯微拉曼光譜儀具有高分辨率的成像能力，能夠在微觀尺度上觀察樣品的結構和組織。在呼吸道疾病病原檢測中，這種高空間分辨率能夠幫助研究者準確定位和觀察微小的病毒顆粒或細胞結構。

深度信息獲取：共聚焦顯微拉曼光譜儀可以實現三維成像，為研究者提供樣品內部的深度信息。這對于理解病原體在不同細胞層次上的分布和相互作用至關重要，有助于更全面地了解呼吸道疾病的發展過程。

實時監測：共聚焦顯微拉曼光譜儀具備實時監測功能，可以追蹤樣品中病原體的動態變化。在呼吸道疾病的研究中，實時監測有助于研究者了解病毒的生命周期、感染過程以及治療干預的效果。

減少背景干擾：共聚焦顯微拉曼光譜儀通過對焦點進行精確控制，能夠減少背景信號的干擾。這對于在復雜的生物樣本中進行高靈敏度的SERS檢測尤為重要，以確保檢測結果的準確性和可靠性。

奧譜天成ATR8800系列顯微拉曼光譜儀，集成了最多達4個激光器，并結合了顯微鏡及拉曼光譜儀兩者的優點，顯微拉曼檢測平臺使得“所見即所測”成為可能，可視化的精確定位拉曼檢測平臺，使得觀測者可以檢測樣品上不同表面狀態的拉曼信號，并可在計算機上同步顯示所檢測位置的微區形態，極大便利了拉曼微區檢測。

ATR8800全系列可以進行全自動對焦、全自動掃描，一鍵操作，可以進行批量實驗、均勻性掃描等，無需等待，且可以獲得高可靠性的掃描成像拉曼數據；

ATR8800配備不同焦距的光譜儀，以達到不同分辨率的要求，ATR8800還配備專門為拉曼系統設計的物鏡，使得激光光斑接近衍射極限，再通過500萬相機將焦點信息準確直觀的顯示在電腦上。克服了普通的拉曼系統中收集拉曼信號的焦面稍高于或稍低于實際**焦面的問題，從而提高拉曼光譜質量。

ATR8800完美地解決了相機成像時光路的損失，實現了相機成像與拉曼信號收集的分離，從而得到**的信號強度。同時，ATR8800使用專門為顯微拉曼系統優化的高性能拉曼，無論是靈敏度，信噪比，穩定性等，都是行業領先水平，為拉曼研究提供了強有力的保障。

參考文獻：

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Chen, Hao, et al. "SERS-based dual-mode DNA aptasensors for rapid classification of SARS-CoV-2 and influenza A/H1N1 infection."
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